Bolsa de PD em Parasitologia / Virologia

Post-doctoral Fellowship in Parasitology / Virology

• Resumo Summary

  A Plataforma Científica Pasteur-USP anuncia a abertura de uma vaga de pós-doutorado no âmbito do Projeto Temático “Estratégia integrada para o estudo de agentes infecciosos causadores de doenças emergentes e/ou negligenciadas transmitidas por vetores de impacto global”. 

  A vaga está relacionada ao subprojeto 4 do Temático denominado “Impacto das infecções por Trypanosoma vivax na travessia/rompimento da barreira hematoencefálica em sistemas murinos”. O candidato selecionado receberá uma bolsa de pós-doutorado da FAPESP com duração de 24 meses.

  O principal objetivo do subprojeto consiste em desenhar o processo de comprometimento cerebral por T. vivax e as consequências funcionais/letais decorrentes do processo de infecção, em especial das principais lesões histopatológicas do cérebro, formando uma base de estudos focados na neuroinflamação e na ruptura da barreira hematoencefálica. A pesquisa servirá de base para a interface com outros subprojetos do estudo temático envolvendo infecções com clones infecciosos do vírus Zika, modificados por genes repórter para análise do processo infeccioso in vitro e in vivo por imagiologia 2D e 3D.

  O bolsista participará da investigação da interação de microrganismos patogênicos animais e humanos com hospedeiros experimentais através de estudo de imagens em tempo real não invasivas. A participação do bolsista no projeto e nos subprojetos associados será fundamental pois requer, além da experiência de laboratório descrita nos requisitos abaixo, o conhecimento de gerenciamento de projetos e, fundamentalmente, o conhecimento de normas de biossegurança e qualidade.

  Sumário do Subprojeto 4

  Para melhor estudar as infecções com T. vivax em modelos experimentais bem estabelecidos, o estado da arte das ferramentas de imagens in vitro, in vivo e ex vivo que estavam disponíveis foi revisitado por nosso grupo e adaptado à tripanossomatídeos, gerando novas e mais potentes ferramentas imprescindíveis para sistemas de imagiologia (Goyard et al., 2013; Rouault et al., 2016; Dias de Melo et al., 2017). Estes esforços nos permitem hoje quantificar em tempo real as particularidades, a abundância e a magnitude das infecções causadas por tripanossomatídeos, bem como revelar dados originais relacionados ao desenvolvimento da patologia – abrindo desta maneira novas oportunidades de pesquisa e inovação. Nossos resultados preliminares descreveram o desenvolvimento de um modelo de referência para T. vivax, especialmente devido à alta virulência para o camundongo e a dificuldade do parasita para crescer em culturas axênicas. No entanto, para estudar a tripanossomose animal, Nagana, e caracterizar alguns dos principais atores da imunopatologia causada pelo T. vivax, o nosso laboratório desenvolveu as complexas culturas axênicas de T. vivax de uma cepa Africana e domina hoje o processo de diferenciação parasitária em formas infecciosas in vitro (D’Archivio et al., 2011). Infecções reprodutíveis foram obtidas em camundongos de várias linhagens, que apresentaram parâmetros parasitológicos, histológicos e patológicos muito similares aos observados no campo, característicos da tripanossomose do gado – anemia aguda grave, trombocitopenia e uma redução importante de linfócitos B após a infecção (Chamond et al., 2010; Blom-Potar et al., 2010). Os estádios de T. vivax cultivados in vitro permitiram que o laboratório construísse os primeiros vetores específicos de expressão, que nos levaram a desenvolver a genética reversa para este parasita (D’Archivio et al., 2011). Assim, o domínio das culturas axênicas foi útil para estabelecer e otimizar as transfecções do parasita e selecionar mutantes estáveis que continuem a metaciclogênese mantendo a virulência para camundongos imunocompetentes. A região contendo o promotor ribossomal de T. vivax foi inserida no plasmídeo visando melhorar a expressão do transgene do gene repórter para a luciferase e permitir a integração do vetor no genoma. Com estas ferramentas, o grupo analisou a evolução do processo infeccioso e a distribuição de parasitas nos tecidos de camundongos. Os resultados corroboraram o uso da análise biofotônica em tempo real para estudar e monitorar o processo infeccioso in vivo. Através destes experimentos, pudemos sugerir que a barreira hematoencefálica (BBB) é atravessada por tripanosomas nos estágios mais tardios da infecção (D’Archivio et al. 2013). Os T. vivax, de fato, penetram o parênquima cerebral, pouco antes da morte dos animais.

  Principais metodologias:

  Infecções in vivo. Parasitas Trypanosoma vivax (IR1392) serão utilizados para as infecções de camundongos como modelo experimental. O delineamento e o seguimento das infecções in vivo e a escolha dos modelos animais adequados serão efetuados no laboratório. A participação das células CD5B na resistência e susceptibilidade das cepas escolhidas de camundongo, assim como a análise do processo infeccioso in vivo (citocinas, marcadores de diferenciação celular) serão efetuados por técnicas padrão envolvendo kit de 'beads multiplex' (FCAP, Cytometric Bead Array, Becton Dickinson) para citocinas Th1/Th2/Th17, anticorpos monoclonais dirigidos contra moléculas de adesão, marcadores de superfície celular, etc., e citometria em fluxo (AccuriTm C6 Cytometer System, Becton Dickinson).

  Citometria de fluxo. Serão utilizados anticorpos específicos para proteínas de interesse (leucócitos, células da glia, mediadores, citocinas, quimiocinas moléculas de adesão, tais como S100beta, NSE, GFAP, albumina). A citometria em fluxo será avaliada utilizando-se um FACS Accuri (Becton Dickinson); os eventos serão adquiridos e analisados utilizando-se o programa FlowJo (Tree Star, Inc). Quando necessário, marcadores específicos de neuroinflamação serão quantificados por radioimunoensaio.

  PCR quantitativo. As células serão submetidas à extração de RNA usando Trizol Reagente (Life Technologies), seguindo as instruções do Fabricante. O cDNA obtido será submetido a PCR quantitativa (qPCR) utilizando SYBR green Supermix (Bio-Rad - CA, USA).

  Ensaios de imunofluorescência. Realizar-se-ão para marcação dos diversos tipos celulares neurais para verificação da sinaptogênese, com anticorpos que reconhecem especificamente botões pré e pós-sinápticos. Após a marcação das sinapses, as células serão analisadas por microscópio de fluorescência e as quantificações serão feitas usando o software IMARIS (Bitplane, MA, USA). 

  Análise de múltiplos fatores secretados em sobrenadantes de culturas celulares. Terão como referência o painel 27- plex: IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17, eotaxin, basic FGF, GCSF, GM-CSF, IFN-γ, IP10, MCP-1 (MCAF), MIP-1α, MIP-1β, PDGF-BB, RANTES, TNFα, VEGF.

  Estudos de imagem in vivo. Camundongos serão anestesiados e analisados na câmera de imagem do aparelho Newton 7.0 (Vilber). Quando se tratar de animais infectados com parasitas luminescentes, os animais serão previamente injetados i.p. com D-luciferin (122799, PerkinElmer, Walthan, MA, USA) – substrato da luciferase. Imagens 2D de imunofluorescência ou de luminescência serão adquiridas e regiões de interesse (ROI) dos órgãos de interesse serão determinadas usando o programa “Living Image” (Perkin Elmer). 

  Estudos de RT-PCR. A RT-PCR será utilizada quando necessário quantificar os transcritos de mediadores da resposta inflamatória ou ainda a carga tissular parasitária. Oligonucleotídeos de referência para os transcritos a serem analisados serão escolhidos de acordo com nossa experiência. A apreciação da permeabilidade da barreira hematoencefálica e/ou de lesões neuronais decorrentes da infecção será feita, por exemplo, pela dosagem de proteínas unicamente cerebrais ou séricas no líquido cefalorraquidiano, no soro e no plasma dos camundongos. A anexina 1, produzida pelas células endoteliais microvasculares do cérebro, assim como marcadores de apoptose, de hipóxia e de processos hemorrágicos fluorescentes, ou ainda marcadores de inflamação tais como citocinas e marcadores específicos de neuroinflamação serão quantificados. As técnicas privilegiadas serão: imunohistoquímica para detecção da micróglia (anti-Iba-1) e dos astrócitos (GFAP) e citometria em fluxo para citocinas inflamatórias, quimiocinas e moléculas de adesão (CBA ou luminex). Citocinas envolvidas na ruptura da barreira haematoencefálica serão particularmente estudadas (IL-1-beta, IL-6 e TNFalfa). Estudos de histopatologia serão realizados em paralelo para análise da neuroinflamação pela presença igualmente de linfócitos T, B, Macrófagos com anticorpos de diferenciação celular apropriados. 

  Dosagem de proteínas circulantes e cerebrais. As proteínas S100beta, NSE, GFAP, albumina serão analisadas no líquido cefalorraquidiano e no soro, e sua presença comparada com níveis obtidos no plasma. Anticorpos monoclonais diretamente marcados e especificamente dirigidos contra estes marcadores cerebrais serão utilizados em testes de imunoensaio (Elisa, Westernblot) e imunohistoquimica (anti-Iba-1 e GFAP).

  Atividades do projeto de pesquisa:

  1. Adaptar as culturas do parasita Trypanosoma vivax desenvolvidas anteriormente (PLoS Negl Trop Dis. 2011 Dec;5(12):e1461) na nova plataforma, clonar, sequenciar e expressar genes dos parasitas, do hospedeiro e/ou genes repórter (do 1º ao 18º mês de bolsa);

  2. Manter cultivos celulares e realizar experimentos de transfecção (do 5º ao 12º mês e entre os meses 17 e 20);

  3. Inocular animais com parasitas expressando genes repórter e estudar o processo (imuno)inflamatório e suas consequências sobre o comprometimento das barreiras cerebral e hematoencefálica usando técnicas de imunologia e de imagiologia não invasivas em tempo real (do 5º ao 12º mês e entre os meses 17 e 20);

  4. Interagir com os colegas dos subprojetos associados para a geração de clones infecciosos de ZIKV (do 7º ao 20º mês);

  5. Participar das infecções e análises do processo infeccioso experimental in vitro e in vivo com clones virais usando as tecnologias 2D e 3D de imagiologia em tempo real, em condições de confinamento NB2 e NB3 (entre os meses 7 e 10, 15 e 18 e 21 e 24 da bolsa).

  O candidato praticará a escritura de manuscritos para submissão. 

  Requisitos: 

  O candidato a PD deverá ter experiência prévia em parasitologia e/ou virologia, técnicas em imunologia, microscopia, biologia molecular e celular que permitam o exercício: 1) de clonagem, sequenciamento e expressão de genes, 2) de culturas de células procarióticas e eucarióticas e experimentos de transfecção e 3) da inoculação de animais. Serão priorizados os candidatos que tenham proficiência em inglês e francês. 

  A inscrição deve ser feita via e-mail, enviando carta de apresentação, Curriculum Vitae ou Currículo Lattes e duas cartas de recomendações para a coordenadora do projeto, Paola Minoprio (paola.minoprio@pasteur.fr), até o dia 15 de setembro de 2019.

  Justificativas para o Plano em termos dos objetivos do Programa de Bolsas PD da FAPESP

  Contribuir para o conhecimento, desenvolvimento e adaptação tecnológica voltada ao combate ao entendimento de neuroinvasividade e neurodegeneração causada por infecções de patógenos; estabelecer e incrementar o treinamento de pesquisadores envolvidos no processo, bem como o desenvolvimento de habilidades específicas; formação de recursos humanos altamente qualificados para pesquisa de ponta no Brasil; colocar o Brasil em evidência como fomentador de pesquisa de qualidade e relevância no cenário científico mundial.

  A oportunidade de pós-doutorado está aberta a brasileiros e estrangeiros. O selecionado receberá Bolsa de Pós-Doutorado da FAPESP no valor de R$ 7.373,10 mensais e Reserva Técnica equivalente a 15% do valor anual da bolsa para atender a despesas imprevistas e diretamente relacionadas à atividade de pesquisa.

  The Pasteur-USP Scientific Platform has one post-doctoral position available under Thematic Project “Integrated strategy for the study of infectious agents that cause emerging and / or neglected diseases transmitted by vectors of global impact”.

  The opportunity is related to the subproject number four of the Thematic Project entitled “Impact of Trypanosoma vivax infections on blood brain barrier crossing / disruption in murine systems”. The selected candidate will receive a 24 month Post-Doctoral fellowship granted by FAPESP, the São Paulo Research Foundation.

  Subproject four aims at deciphering the T. vivax brain impairment process and the functional / lethal consequences of the infection process, especially the main histopathological lesions of the brain, thus forming a base of studies focused on neuroinflammation and the breakdown of the blood-brain barrier. The project will serve as the basis for interfacing with other subprojects of a thematic study involving infections with Zika virus infectious clones, modified by reporter genes for the analysis of the infectious process in vitro and in vivo using 2D- and 3D- imaging.

  The PD fellow will participate in the investigation of animal and human pathogenic microorganisms’ interactions with experimental hosts through the study of noninvasive real time images. The grantee's participation in the project and associated subprojects will be critical as it requires in addition to the laboratory experience described in the requirements below, knowledges of project management and, necessarily, of biosafety and quality standards.

  Subproject 4 Summary

  To better study T. vivax infections in well-established experimental models, our group had revisited the state-of-the-art of available in vitro, in vivo and ex vivo imaging tools, generating new and more powerful essential and specific tools for imaging trypanosomatids (Goyard et al., 2013; Rouault et al., 2016; Dias de Melo et al., 2017). These efforts allow us today to quantify in real time the particularities, abundance and magnitude of trypanosomal infections, to reveal original data related to the development of the pathology, thus opening new research and innovation opportunities. Our preliminary results described the development of a reference model for T. vivax, especially due to the high virulence of the mouse and the parasite's difficulty to grow in axenic cultures. However, to study animal trypanosomosis, Nagana, and to characterize some of the major actors in T. vivax immunopathology, our laboratory has developed further the complex T. vivax axenic cultures of an African strain and today masters the process of parasitic differentiation into in vitro infectious forms (D'Archivio et al., 2011). Reproducible infections were obtained in mice of several strains, which presented parasitological, histological and pathological parameters very similar to those observed in the field, characteristic of cattle trypanosomosis – severe acute anemia, thrombocytopenia and a significant reduction of B lymphocytes after infection (Chamond et al. (2010; Blom-Potar et al., 2010). The in vitro cultivated T. vivax stages allowed the laboratory to construct the first specific expression vectors, which led us to develop reverse genetics for this parasite (D'Archivio et al., 2011). Thus, establishment of axenic cultures was useful for establishing and optimizing parasite transfections and selecting stable mutants that continue metacyclogenesis while maintaining virulence for immunocompetent mice. The region containing the T. vivax ribosomal promoter was inserted into the plasmid to improve expression of the luciferase reporter gene transgene and to allow integration of the vector into the genome. With these tools, the group analyzed the evolution of the infectious process and the distribution of parasites in mouse tissues. The results corroborated the use of realtime biophotonic analysis to study and monitor the infectious process in vivo. Through these experiments, we could suggest that the blood-brain barrier (BBB) is crossed by trypanosomes in the later stages of infection (D'Archivio et al. 2013). T. vivax, in fact, penetrate the brain parenchyma shortly before the death of the animals.

  Main methodologies

  Infections in vivo. Trypanosoma vivax parasites (IR1392) will be used for mouse infections as an experimental model. Outline and follow-up of infections in vivo and the choice of appropriate animal models will be performed in the laboratory. The participation of CD5B cells in the resistance and susceptibility of the chosen mouse strains, as well as the analysis of the in vivo infectious process (cytokines, markers of cell differentiation) will be performed by standard techniques involving FCP (Cytometric Bead Array , Becton Dickinson) for Th1 / Th2 / Th17 cytokines, monoclonal antibodies directed against adhesion molecules, cell surface markers, etc., and flow cytometry (AccuriTm C6 Cytometer System, Becton Dickinson).

  Flow cytometry. Specific antibodies for proteins of interest (leukocytes, glial cells, mediators, cytokines, chemokines, adhesion molecules such as S100beta, NSE, GFAP, albumin) will be used. Flow cytometry will be evaluated using a FACS Accuri (Becton Dickinson), while events will be acquired and analyzed using the FlowJo program (Tree Star, Inc). When necessary, specific neuroinflammatory markers will be quantified by radioimmunoassay.

  Quantitative PCR. Cells will be subjected to RNA extraction using Trizol Reagent (Life Technologies) following the manufacturer's instructions. The cDNA obtained will be subjected to quantitative PCR (qPCR) using SYBR green Supermix (Bio-Rad - CA, USA).

  Immunofluorescence assays will be performed to label the various neural cell types for synaptogenesis verification, with antibodies that specifically recognize presynaptic and postsynaptic buttons. After marking the synapses, cells will be analyzed by fluorescence microscope and quantifications will be made using IMARIS software (Bitplane, MA, USA). Multiple-factor secretion analysis in cell culture supernatants with reference to panel 27-plex: IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 , IL-9, IL-10, IL12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17, eotaxin, basic FGF, GCSF, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1 (MCAF), MIP-1α, MIP-1β, PDGF-BB, RANTES, TNFα, VEGF.

  Imaging studies in vivo. Mice will be anesthetized and analyzed on the Newton 7.0 (Vilber) imaging camera. When animals are infected with luminescent parasites, the animals will be previously injected i.p. with D-luciferin (122799, PerkinElmer, Walthan, MA, USA) – luciferase substrate. Immunofluorescence or luminescence 2D images will be acquired and regions of interest (ROI) of the organs of interest will be determined using the Living Image program (Perkin Elmer).

  RT-PCR studies. RT-PCR will be used when necessary to quantify inflammatory response mediators transcripts or parasitic tissue load. Reference oligonucleotides for the transcripts to be analyzed will be chosen from our experience.

  Assessment of the blood-brain barrier permeability and / or neuronal lesions resulting from the infection will be made, for example, by the measurement of only brain or serum proteins in the cerebrospinal fluid, serum and plasma of mice. Annexin 1, produced by brain microvascular endothelial cells, as well as markers of apoptosis, hypoxia and fluorescent bleeding processes, or markers of inflammation such as cytokines and specific markers of neuroinflammation will be quantified. The privileged techniques will be: immunohistochemistry to detect microglia (anti-Iba-1) and astrocytes (GFAP) and flow cytometry for inflammatory cytokines, chemokines and adhesion molecules (CBA  r luminex). Cytokines involved in blood-brain barrier rupture will be particularly studied (IL-1-beta, IL-6 and TNFalpha).

  Histopathology studies will be performed in parallel for analysis of neuroinflammation by the presence also of T, B lymphocytes, macrophages with appropriate cell differentiation antibodies.

  Dosage of circulating and brain proteins. S100beta, NSE, GFAP, and albumin proteins will be analyzed in cerebrospinal fluid and serum, and their presence compared to plasma levels. Monoclonal antibodies directly labeled and specifically directed against these brain markers will be used in immunoassay (Elisa, Westernblot) and immunohistochemical (anti-Iba-1 and GFAP) tests. 

  Research project activities: 

  1. Adapt on the new platform the Trypanosoma vivax cultures previously developed (PLoS Negl Trop Dis. 2011 Dec; 5 (12): e1461), clone, sequence and express parasite, host and / or reporter genes;

  2. Maintain cell cultures and perform transfection experiments;

  3. Inoculate animals with parasites expressing reporter genes and study the inflammatory (immune) process and its consequences on the impairment of brain and blood brain barriers using noninvasive imaging techniques in real time and immunological approaches;

  4. Interact with colleagues from associated subprojects for generation of infectious ZIKV clones;

  5. Participate in infections and analyses of the in vitro and in vivo experimental infectious processes with viral clones under NB2 and NB3 confinement conditions.

  The candidate will practice writing manuscripts for submission.

  Requirements: 

  The candidate for PD must have previous experience in parasitology and / or virology, techniques in immunology, microscopy, molecular and cellular biology that allow the exercise: 1) cloning, sequencing and gene expression, 2) prokaryotic and eukaryotic cell cultures and transfection experiments and 3) animal inoculation. Priority will be given to candidates who have proficiency in English and French. 

  Applications must be submitted via e-mail, sending a cover letter, Curriculum Vitae or Curriculum Lattes and two letters of recommendation to the project coordinator, Paola Minoprio (paola.minoprio@pasteur.fr), by September 15, 2019. 

  Rationale for the Plan in terms of the objectives of the FAPESP PD Scholarship Program

  Contribute to the knowledge, development and technological adaptation aimed at combating the understanding of neuroinvasivity and neurodegeneration caused by pathogen infections; establish and increase the training of researchers involved in the process, as well as the development of specific skills; highly qualified human resources training for cutting-edge research in Brazil; put Brazil in evidence as a promoter of quality research and relevance in the world scientific scenario.

  The post-doctoral opportunity is open to Brazilians and foreigners. The candidate will receive a FAPESP Post-Doctoral Fellowship in the amount of R $ 7,373.10 per month and a Technical Reserve equivalent to 15% of the annual scholarship amount to meet unforeseen expenses directly related to the research activity.